41Nachweis von Eigenblutdoping BISp Jahrbuch Forschungsförderung 2014 15 2 3 Blutspende und Blutkomponentenherstellung Für die VBS von 500 ml wurde das Composelect T3984 23 System Fresenius Bad Homburg Deutsch land verwendet Für Gruppe 1 wurde im ersten Beutel des Systems bereits enthaltenes 70 ml CPD Cit rate Phosphate Dextrose Puffer mit 500 ml frischem Vollblut des Probanden gemischt und anschlie ßend die Leukozytendepletion über einen integrierten Filter durchgeführt Dieser Beutel wurde dann als VB bei 4 2 C gelagert Für die Gruppe 2 wurde genauso verfahren allerdings wurde das gefil terte VB für die weitere Blutkomponentenherstellung verwendet anstatt es direkt zu lagern Für die Auftrennung in die Blutkomponenten Plasma und EK wurde das gefilterte VB bei 3998 g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und das Plasma anschließend am Compomat G4 Fresenius Bad Homburg Deutschland in einen weiteren im System befindlichen Beutel abgetrennt Das im Beutel verbliebene EK wurde für bessere Lagerungsbedingungen mit 110 ml PAGGS M Phosphate Adenine Glucose Guanosine Saline Mannitol Puffer gemischt und bei 4 2 C für bis zu 10 Wochen kon trolliert gelagert Der über die normale Lagerdauer hinausgehende Zeitpunkt 10w ist vorgesehen um die Sicherheit der Detektion von Lagerungsschäden und deren physiologischen Veränderungen zu erhöhen Für den Versuch wurde das Votum der zuständigen Ethikkommission eingeholt 2 4 RNA Extraktion und RNA Sequenzierung Die Blutproben wurden mit dem PAXgene Blood RNA Tube von PreAnalytiX Hombrechtikon Schweiz entnommen über Nacht inkubiert und bis zur Extraktion bei 20 C gelagert Die Röhrchen enthalten eine Stabilisierungslösung welche die RNA vor Degradierung schützt und gleichzeitig das aktuelle RNA Profil fixiert um eine weitere Induktion der Genexpression zu verhindern Die totale RNA wurde mit dem PAXgene miRNA Extraction Kit Qiagen Hilden Germany extrahiert photome trisch mit dem NanoDrop ND 1000 UV Vis Spectrophotometer 1000 Thermo Fisher Scientific Wal tham USW quantifiziert und deren Qualität mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technolo gies Palo Alto USA gemessen Becker Hammerle Fickinger Riedmaier Pfaffl 2010 Fleige Pfaffl 2006 Für die erste Identifizierung von geeigneten Biomarkerkandidaten auf miRNA Ebene wurde eine small RNA Sequenzierung small RNA Seq auf einer Illumina HiSeq 2500 Plattform Illumina USA wie bereits von Spornraft et al beschrieben durchgeführt Spornraft et al 2014 Für die Vorbe reitung der Proben Library Preparation wurde das NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England BioLabs Ipswich USA verwendet Die EK Proben 3w 2w 1w 0w 1w 2w 4w und 6w von 6 Probanden wurden sequenziert und ausgewertet Der Zeitpunkt 10w wurde von allen Probanden aus technischen Gründen ausgeschlossen Da eine small RNA Seq sehr kostspielig ist erfolgt eine Validierung der small RNA Seq Daten in allen verfügbaren Proben 10 Probanden EK 10 Probanden VB mittels RT qPCR 2 5 Statistische Analyse Die Vorgehensweise bei der Zuordnung Mapping der gelesenen Fragmente Reads einer small RNA Seq zu bereits annotierten small RNAs wurde bereits beschrieben Spornraft et al 2014 Die ersten Analysen konzentrieren sich auf die Auswertung der am besten untersuchten small RNA Klasse den microRNAs miRNA Die Daten wurden mit einem intern etablierten Protokoll auf R Basis ausgewer tet und mit Hilfe der GenEx Software Pro MultiD Analysis Sweden mit multivariaten Datenanalyse Techniken z B PCA HCA visualisiert Die Anzahl der Reads wurden mit Hilfe des DESeq Algorith mus normalisiert Anders 2011 Zur Reduzierung der falsch positiven Kandidaten wurde ein Cut Off bei 50 Reads im Durchschnitt pro miRNA eingeführt

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